如何安全便捷地表达蛋白

体外基因表达系统包括原核细胞系统和真核细胞系统。原核细胞系统主要是大肠杆菌细胞系统，它操作简便，周期短，收益大，表达产物稳定，但是表达基因的分子量有限，不宜过大，且不能对表达产物进行一些翻译后加工作用。真核细胞系统包括COS细胞、CHO细胞、酵母细胞和昆虫细胞等表达系统。昆虫细胞表达系统（即杆状病毒表达系统）独特的生物学特性，日益受到人们的重视。昆虫细胞培养及操作较简便，成本低，因此被广泛用于生产基因工程产品。

Bac-to-Bac杆状病毒表达系统促进了重组杆状病毒的快速有效产生。基于Luckow等人1993年开发的方法，Bac-to-Bac杆状病毒表达系统利用Tn7转座子的位点特异性转座特性来简化和增强产生重组bacmid DNA的过程。Bac-to-Bac杆状病毒表达系统促进了重组杆状病毒的快速有效产生。基于Luckow等人1993年开发的方法，Bac-to-Bac杆状病毒表达系统利用Tn7转座子的位点特异性转座特性来简化和增强产生重组bacmid DNA的过程。

该系统的第一个主要组成部分是一个pFastBac载体，目的基因将被克隆到该载体中。根据所选的pFastBac载体，目的基因的表达由苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(AcMNPV)多角体蛋白或p10启动子控制，以便在昆虫细胞中高水平表达。该ORF两侧是Tn7的左臂和右臂，并且还包含庆大霉素抗性基因和SV40聚腺苷酸化信号以形成迷你Tn7。

该系统的第二个主要组成部分是用作pFastBac载体宿主的DH10Bac大肠杆菌菌株。DH10Bac细胞含有一个杆状病毒穿梭载体(bacmid)，该载体带有一个迷你attTn7靶位点和一个辅助质粒。一旦pFastBac表达质粒转化到DH10Bac细胞中，pFastBac载体上的mini-Tn7元件和bacmid上的mini-AttN 7靶位点之间就会发生转座，从而产生重组bacmid。这种转座反应发生在辅助质粒提供的转座蛋白存在的情况下。一旦你进行了转座反应，你将分离高分子量的重组杆状病毒DNA，并将杆状病毒DNA转染到昆虫细胞中，以产生可用于初步表达实验的重组杆状病毒。在杆状病毒储备被扩增和滴度测定后，这种高滴度储备可用于感染昆虫细胞以大规模表达重组蛋白。

重组杆状病毒的产生以及使Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达目的基因：

AcBac的构建策略是将一拷贝的大肠杆菌Tn7转座子靶位点mini-att Tn7（置于LacZα片段内以方便进行重组子的蓝白斑选择）、复制子mini-F和卡那霉素抗性基因Kan插入AcMNPV基因组的polyhedrin基因位置，取代了杆状病毒非必需基因polyhedrin的编码序列而获得。由于拥有大肠杆菌F因子的复制子mini-F，使得AcBac可在大肠杆菌中复制，而将AcBac DNA从大肠杆菌中提取出来转染昆虫细胞后，及可获得有感染力的重组杆状病毒AcBac。

Bac-to-Bac系统实际上包含了三个质粒：大质粒AcBac ( bMON14272)；供体质粒pFastbac系列，其上含有两个大肠杆菌Tn7转座子的靶位点，靶位点间含有多克隆位点及抗性选择标记庆大霉素基因；辅助质粒pMON7124则提供发生转座所需的转座酶。DH10Bac菌株内含大质粒bMON14272和辅助质粒pMON7124。

利用 Bac-to-Bac系统构建重组杆状病毒时，首先将外源基因克隆到供体质粒pFastbac的多克隆位点上，然后用普通CaCl2法将供体质粒转化进含AcBac( bMON14272) 和辅助质粒pMON7124的大肠杆菌DH10Bac中，在辅助质粒提供的转座酶作用下，外源基因转座到AcBac多角体基因位点的LacZα片段上的mini att Tn7位点，通过蓝白斑筛选获得重组Bacmid。提取重组BacmidDNA转染昆虫细胞系，即可获得可表达目的基因的重组病毒。

使用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达目的基因所需的一般步骤：

与使用同源重组的传统方法相比，使用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统产生重组杆状病毒具有以下优点：

1、鉴定和纯化重组杆状病毒所需时间不到2周，而使用同源重组产生重组杆状病毒需要4-6周；

2、由于从选定菌落分离的重组病毒DNA不与亲本、非重组病毒混合，因此减少了多轮空斑纯化的需要；

3、允许快速同时分离多种重组杆状病毒。

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